6.4. Histopatologisk diagnostikk

Klassifikasjon av melanom

Den tradisjonelle histologiske klassifikasjon av melanomer i hud (Clark et al., 1969) baserer seg i hovedsak på tilstedeværelsen av en in situ-komponent og utseendet av denne, eller fravær av en slik komponent, men også i noen grad på utseendet av den invasive komponenten. Enkelte melanomer kan være vanskelig å klassifisere. Melanomene inndeles i fire hovedtyper, i tillegg til sjeldnere varianter:

1. Melanom av superfisiell spredningstype
2. Nodulært melanom
3. Lentigo maligna melanom
4. Akralt melanom

In situ komponent

Ved melanom av superfisiell spredningstype har epidermis varierende tykkelse, men den er ikke atrofisk. Her sees vekst av oftest epiteloide, atypiske melanocytter langs basallaget, dels som større og mindre, konfluerende reder, dels også med lineær vekst. I tillegg sees pagetoid vekst av atypiske melanocytter oppover i epidermis, helt opp i granulærcelle­laget. In situ-komponenten finnes utenfor den invasive del av tumor, enten utbredt hele veien rundt denne, eller bare som et asymmetrisk fokus. Det er viktig for korrekt klassifikasjon at tumor fjernes in toto.

Ved nodulært melanom er det ingen primær vekst av tumorceller i epidermis til siden for den invasive del av tumor, selv om en kan se sekundær innvekst i epitelet over tumor eller i kanten av denne. Epidermal affeksjon kan mangle helt.

Ved lentigo maligna er epidermis tynn og atrofisk, og det skal være tydelig tegn på aktinisk skade av bindevevet i underliggende dermis (solar elastose). Det sees en overveiende lineær, enlaget eller flerlaget vekst av atypiske epiteloide eller spolformede melanocytter langs basallaget av epidermis og øvre del av hårfolliklene, og enkelte reder kan sees.

Ved akralt melanom har epidermis preg av regionen (fotsåle/håndflate, tå/finger, subungualt), det vil si at den er tykk med forlengede retelister. Epidermis viser en kontinuerlig vekst av atypiske melanocytter, stedvis med rededannelse, som ofte er uskarpt avgrenset, dyskohesive og horisontalt orientert i forhold til epidermis. Vekst av atypiske melanocytter til høyere epidermallag (pagatoid vekst) befinner seg som regel langs hudrygger, svarende til pigmenteringsmønster. Dette er i motsetning til akrale nevi hvor pagatoid vekst sees langs furene. Av den grunn, biopsitakning perpendikulært for hudrygger og furer er essensielt for å skille mellom akrale nevi og melanomer histologisk (Nakamura et al., 2018).

En subgruppe av akralt melanom er subungualt melanom; en sjelden type som oppstår i neglematrix og sprer seg horisontalt til negleplate, neglefold og hyponykium, og vertikalt i dermis som melanomer i andre anatomisk lokalisering. Histologisk undersøkelse viser kontinuerlig voksende atypiske melanocytter lentiginøst (Littleton et al., 2019).

Invasiv komponent

Den invasive del av melanomet kan variere betydelig i utseende, avhengig av type, men også innenfor hver hovedtype av melanomer. Det kan være diffus eller knutet vekst av tumorceller, og disse kan være epiteloide eller spolformede, små eller store, av og til flerkjernede. Uvanlige celletyper kan sees, som signetringceller og formasjoner som ligner kjertler, og kar kan også forekomme. Cellene kan inneholde tydelig melaninpigment eller mangle dette (amelanotisk melanom). Det siste gjelder særlig nodulære melanomer. Desmoplastisk melanom er en variant av spolcellet melanom som alltid er i vertikal vekstfase (se nedenfor) og ofte amelanotisk. Tumor kan utgå fra lentigo maligna, og finnes særlig på hode og hals hos eldre. Det sees dyp og diffus (ofte neurotrop) infiltrasjon i et cellerikt, fibrøst stroma, og dette krever særlig stor eksisjonsbredde.

Hvis det dermale tumorvevet ikke henger tydelig fast på undersiden av epidermis, og især hvis man samtidig ikke finner noen epidermal tumorkomponent, bør patologen vurdere mulighet for melanommetastase. Klinisk korrelat er nødvendig for å fremme riktig diagnose. Hvis man i en slik situasjon heller ikke finner sikkert melaninpigment, bør det utføres immunhistokjemisk undersøkelse for å vise at det foreligger en melanocytt-derivert tumor. Andre tilstander, som funn av regressive forandringer superfisielt i dermis, kan representere regresjon i en primærtumor, og bør derfor ikke feiltolkes som metastase. Samme gjelder andre type «sjeldnere» melanomer for eks. melanomer i blå- eller kongenitte nevi som vanligvis mangler epidermal komponent.

Karakterisering av melanom

Histologisk informasjon er viktig for behandling og videre vurdering av melanompasienter. Mengden av tumorvev indikerer den forventede prognose. De viktigste variablene i henhold til siste TNM-klassifikasjon (AJCC 8. utg.) er tumortykkelse og ulcerasjon, men infiltrasjonsdybde etter Clark, mitosetall og andre forhold bør også vurderes og rapporteres (se nedenfor).

I siste utgave av TNM-klassifikasjonen foreligger det visse endringer når det gjelder hvilke patologivariable som kreves for pTNM kategorisering i forhold til tidligere. Clark’s infiltrasjonsnivå er så og si ute av klassifikasjonen, mens infiltrasjonsdybde og ulcerasjon har erstattet mitosetall for subkategorisering av pT1. Dette betyr ikke at Clark’s nivå og andre patologivariable ikke har verdi og ikke skal rapporteres (se senere kommentarer).

1. Tumortykkelse (ad modum Breslow)

Tumortykkelse regnes fortsatt for å være den viktigste histologiske enkeltfaktor. Denne måles (helst med mikrometer montert i mikroskopet) som vertikal avstand fra toppen av granulær­celle­laget til den dypeste dermale (invasive) tumorcelle, og angis i millimeter med én desimal. Satellitter i dermis skal ikke inkluderes (Gershenwald et al., 2017). Ved ulcerasjon skal det måles fra bunnen av ulcerasjonen. Grenselagsutbredelse langs hårfollikler skal ikke regnes med. Vurderingen av tumortyk­kelse er ofte usikker/umulig når det foreligger regressive forandringer i tumor; en kan her angi to mål, ett medregnet regressiv sone. Det kan også være problematisk å vurdere tykkelse dersom man har en antatt benign komponent i tillegg og grensen mellom de to ikke er distinkt. Ved stor usikkerhet bør dette drøftes, og man kan i tillegg til tumormål angi maksimal tykkelse.

2. Infiltrasjonsdybde (ad modum Clark)

Nivå 1: Kun intraepidermal vekst (in situ).

Nivå 2: Infiltrasjon i øvre papillære del av dermis.

Nivå 3: Den infiltrerende vekst utfyller hele den papillære dermis som er fortykket.

   Karpleksus på grensen til underliggende retikulære dermis presses nedover.

Nivå 4: Infiltrasjon ned i retikulære dermis.

Nivå 5: Infiltrasjon ned i subkutant fettvev.

Patologen skal tilse at de fremstilte histologiske snitt er representative for tumors vekstmåte og utbredelse, forutsatt at hele tumor er sendt inn. Snittene skal omfatte området med dypest infiltrasjon; som oftest er fornuftig å støpe hele tumor. Hvis det foreligger et in situ-melanom (nivå 1) er det ingen fare for metastasering. Stort sett forverres pasientens prognose med økende dybdevekst av tumor. I tillegg vil tykkelse av hudens ulike lag variere etter lokalisasjon, og dette tilsier at både Breslow og Clark bør rapporteres.

I siste utgave av TNM-klassifikasjonen (AJCC 8. utg.) har infiltrasjonsdybde og ulcerasjon erstattet infiltrasjondybde og mitosetall som grunnlag for subkategorisering av pT1 (Gershenwald et al., 2017; Keung et al., 2018).

Det er fortsatt slik at ved polyppøse melanomer og ved dype ulcerasjoner kan det foreligge et misforhold mellom Breslow og Clark, og det er i slike situasjoner viktig at begge parameterne oppgis. Melanom som oppstår i follikkelepitel med infiltrasjon ned til subkutant fettvev regnes ikke som nivå 5.

3. Tumors vekstfase

Clark og medarbeidere har beskrevet hvordan melanomer gjennomgår forskjellige faser under sin utvikling, og begrepene horisontal (radial) og vertikal vekstfase ble lansert (Clark et al., 1989). Melanomer i horisontal vekstfase regnes for å være «lavgradig» maligne med et svært lite metastaseringspotensial og omfatter såvel in situ-melanomer som melanomer med begrenset invasiv vekst (som regel kun i øvre del av dermis). Melanomer i vertikal vekstfase må oppfattes som mer «høygradig» maligne med økt risiko for metastasering.

For tynne svulster med en relativt begrenset invasiv komponent er det viktig å avgjøre hvorvidt det foreligger horisontal eller vertikal vekstfase. Ved vertikal vekstfase finnes større reder og dominante knuter, og tumorcelle-aggregatene skal være større enn det største epidermale redet. Funn av dermale mitoser (i sikre tumorceller) indikerer en vertikal fase. Disse forand­ringene kan være fokale. Selv om de fleste melanomer som eksideres nå er relativt tynne, kan man påvise vertikal vekstfase blant melanomer helt ned til 0,5 mm i tykkelse. Det er særlig viktig å vurdere vekstfase ved tynne melanomer <1.5 mm, Clark’s nivå 2–3. Derved kan man skille ut lesjoner i vertikal vekstfase med forventet dårligere prognose enn tilsvarende melanom i horisontal vekstfase med samme tykkelse.

I tilfeller der man f.eks. har stilt diagnosen «Invasivt melanom, superfisiell spredningstype, tykkelse 0,7 mm», kan det derfor i beskrivelsen presiseres om det histologiske bildet indikerer horisontal eller vertikal vekstfase.

4. Ulcerasjon

Uavhengig av tumortykkelse, er ulcerasjon forbundet med dårligere prognose og er inkludert i TNM-systemet. Ulcerasjon foreligger ved: defekt gjennom hele epidermis, inkludert stratum corneum og basalmembranen, og tilstedeværelse av reaksjon i sårflaten som fibrin og granulocytter. Ulcerasjon anvendes til subklassifisering av T1-4.

5. Mitosetall

I henhold til siste utgave av TNM-klassifikasjonen (AJCC 8. utg.) anbefales det at mitose­tall angis ved alle primære melanomer. Mitosetall er derimot ikke lenger obligat for subklassi­fisering av pT1. Kategori pT1 (tykkelse £ 1.0 mm) inndeles i pT1a ved manglende ulcerasjon og < 0,8 mm; pT1b foreligger ved enten ulcerasjon uavhengig av infiltrasjonsdybde, eller infiltrasjonsdybde ≥ 0,8 mm £ 1,0 mm.

Vurdering av mitosetall: Området i den dermale (invasive) tumorkomponenten med mest mitotisk aktivitet identifiseres («hot spot»). Deretter telles et antall synsfelt (x400) som i sum minst svarer til 1 mm2 (synsfelt legges «kant-i-kant»). Dette området er ofte ved basis av tumor. Dersom en ikke finner noe «hot spot», anbefales det at man finner et synsfelt med minst 1 mitose og velger dette som startpunkt for deretter å legge til tilstrekkelig antall synsfelt (for minst 1 mm2). Mitosetallet regnes deretter ut som mitoser/mm2. Synsfeltet som benyttes skal måles for hvert mikroskop slik at nøyaktig utregning gjøres (slik som praksis er for mitosetelling i forbindelse med gradering av mammakarsinomer).

Dersom den invasive komponent er mindre enn 1 mm2 i areal, kan en velge å angi antall observerte mitoser og angi dette som et minimumstall per 1 mm2, eller alternativt kan en angi om mitoser er til stede eller ikke. I slike tilfeller kan en også fremstille flere parallelle snitt fra tumorblokken.

6. Andre faktorer ved primærtumor

Histologisk type: I henhold til tradisjonell klassifikasjon av melanomer gir tumortypen i seg selv ingen selvstendig informasjon om pasientens prognose. Imidlertid vil nodulære melanomer ofte være relativt tykke med ulcerert overflate, og dermed er denne typen knyttet til en dårligere prognose. Det motsatte er tilfellet ved f.eks. lentigo maligna melanom, som vanligvis utvikler seg fra lentigo maligna over lang tid og derfor gjennomgående er tynne. Histologisk type har også epidemiologisk interesse og registreres i Nasjonalt kvalitetsregister for melanom (Kreftregisteret, 2022).

Karinnvekst: Denne variabel er i en rekke studier vist å ha prognostisk betydning og bør derfor registreres.

Lymfocyttinvasjon (Tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL)): Dette er også vist å ha prognostisk betydning og bør derfor kommenteres i beskrivelsen. Det er viktig at det er tumorinfiltrerende lymfocytter som skal vurderes og ikke peritumoral lymfocyttær betennelse (Edge et al., 2010; Mihm et al., 2015).

En rekke andre histologiske variable og tumorbiologiske markører er studert i melanomer, og en del av disse har prognostisk betydning. Tilstedeværelse av nekrose og regresjon bør beskrives, og tumorsatellitter bør også registreres. Funn av neurotropisme (tumorvekst langs nerver) bør rapporteres da dette kan ha direkte betydning for kirurgisk behandling.

Mikrosatellitter: Defineres som en lokal melanommetastase som ikke er klinisk erkjennelig. Histologisk fremstår som en ansamling av maligne melanocytter adskilt fra hoved tumor med upåfallende stroma (dvs. uten fibrose eller inflammasjon). I følge den siste TNM klassifisering (AJCC 8. utg.), er det ikke lenge minstekrav for avstand fra hoved lesjonen (men generelt innen 2 cm), heller ikke krav for minste størrelse på ansamling. Mikrosatellitter kan sees i dermis, subkutant fettvev, eller dypere. For å verifisere om ansamlinger er reelt adskilt fra tumor, anbefales nedskjæring av representativt snitt (Gershenwald et al., 2017).

In-transit metastaser: Dette er tumorreder eller knuter i hud eller underhud, hvor avstand fra primærtumor er mer enn 2 cm, men innenfor området til regionale lymfeknuter.

Tumorbiologiske markører: Betydningen av tumorbiologiske markører, for eksempel proliferasjonsmarkøren Ki-67, er ikke endelig klarlagt, selv om denne kan være til noe hjelp ved vurdering av usikre lesjoner (benign/malign).

En annen biologisk markør er Programmed Cell Death Ligand-1 (PD-L1). Denne markøren er ikke enda etablert som prediktiv markør for respons til immunterapi, men er nylig påvist å være assosiert med bedre overlevelse når utrykket av denne markøren i tumorcellene er lav eller negativ (<1%). Dette gjelder først og fremst de metastatiske inoperable melanomer behandlet med kombinert immunterapi, sammenlignet med monoterapi (Daud et al., 2016; Larkin et al., 2019; Weber et al., 2017). Per i dag foreligger ingen klare retningslinjer for histologisk tolkning av PD-L1 positivitet i metastaser fra melanomer. Det anbefales derfor å rapportere andel positive tumorceller i prosent (%). Positive tumorceller omfatter de med både partielt eller fullstendig membranøs positivitet. Alle grader av intensitet (svak, moderat eller sterk) er gjeldende. PD-L1 undersøkelse skal utføres etter rekvisisjon fra klinikker.

BRAF mutasjonsstatus bør kartlegges ved påvisning av første metastase fra melanom. Om immunhistokjemisk undersøkelse for BRAF anvendes, bør videre verifisering av BRAF genmutasjon gjøres gjennom ytterliggere molekylær analyse. Undersøkelsen bør utføres på metastatisk vev, evt. på primærtumor ved tilfeller med sparsomt metastatisk vev.

Ved påvisning av slimhinnemelanomer, bør mutasjonsstatus av NRAS og andre gener som KIT kartlegges på primærtumor ved diagnosesutgangspunkt.

For flere detaljer vises det til «Veileder i biopsibesvarelse av maligne svulster» (Den norske patalogforening, 2016), nyere tekstbøker, TNM-klassifikasjonen (AJCC 8. utg.) og originallitteratur.

7. Lymfeknuter

Ved utført lymfeknutetoalette bør det undersøkes henholdsvis minst 5/10/20 lymfeknuter for lyske-/ axille- og halsglandetoalett, hvis mulig. Det angis hvor mange lymfeknuter som er undersøkt, og hvor mange som er tumorinfiltrert. Det er hevdet at ekstra-nodal tumorvekst har betydning for prognose og dermed behandling, men dette er så langt ikke godt dokumentert. Ekstranodal vekst angis i histolopatologisk undersøkelse.

Histologisk undersøkelse av vaktpostlymfeknuter (Sentinel node biopsi): Det har vært en del diskusjon om hvordan lymfeknutene skal snittes, for eksempel hvor mange nivå som skal undersøkes, og bruk av immunhistokjemi. Det foreligger nå retningslinjer fra EORTC (Chakera et al., 2009), som er oppdatert i de nye retningslinjer fra EORTC 2019 (Cook et al., 2019), og det anbefales at disse i hovedsak følges.

Undersøkelsen gjøres på fikserte og paraffininnstøpte lymfeknuter. Kirurgene sender vanligvis inn 1 eller flere knuter. Disse friprepareres og bør måles (lengde), og det er viktig at ikke kapselen rives av under prepareringen. Hver lymfeknute som er mer enn 3–4 mm tykk bør deles i to langs hilusplan. Lymfeknutene legges i separat blokk (begge halvdeler i samme blokk hvis mulig); store lymfeknuter kan fordeles på flere blokker ved behov.

Lymfeknutene snittes slik at periferien av knutene med intakt kapsel kommer med i sin helhet.

EORTC angir at hver lymfeknute, eller begge halvdeler plassert i 1 blokk, snittes i 6 nivå, hvert nivå adskilt av enten50 µm (for de små lymfeknuter) eller større avstand, for eks. opptil 300 µm (for de store lymfeknuter). Slik justering av snitt-uttak i forhold til lymfeknutestørrelsen skal sikre deteksjon av tumorceller, for å oppnå et nøyaktig estimat av tumorvolum i lymfeknuten. Det tas 4 snitt fra hvert nivå, ett til HE(S), ett til immunhistokjemisk undersøkelse (for eks.  S-100 eller Melan-A); to snitt oppbevares til senere.

Metastaser beskrives med hensyn til utseende (enkeltceller eller cellegrupper). Multilfokale metastaser rapporteres, og antall foci med metastaser angis i tall. Størrelse på den største ansamling måles (mm med 1 desimal). Lokalisasjon (randsinus/subkapsulær, parenchymatøs) og ekstranodal spredning skal også rapporteres.

I henhold til siste utgave av TNM-klassifikasjonen (AJCC 8. utg.) angis det at metastaser som kun er detektert immunhistokjemisk telles med (forutsetter minst 1 «melanocytt-spesifikk» markør (Melan-A, HMB-45, MART 1, SOX10), og det er ikke en nedre grense for hva som kvalifiserer for lymfeknute positivitet.

Diagnoseelementer

I henhold til siste utgave av TNM-klassifikasjonen (AJCC 8. utg), er tykkelse ad modum Breslow og ulcerasjon obligate variabler. Flere andre parametre bør også vurderes og beskrives, og det kan være naturlig å inkludere følgende som hovedrutine:

1. Histologisk type, invasiv eller in situ, vekstfase
2. Tumortykkelse, ved invasjon (Breslow), i tiendedels mm
3. Infiltrasjonsdybde (Clark’s nivå 1–5)
4. Ulcerasjon (påvist/ikke påvist)
5. Mitosetall (omregnet til mitoser/mm2)
6. Andre faktorer (karinnvekst, lymfocyttinfiltrasjon, nevrotropisme, mikrosatellitter, og funn av preeksisterende benign nevus)
7. Reseksjonsrender
8. Lymfeknutestatus

Anbefalinger:

• Patologisvar bør besværes med Breslow tykkelse og ulcerasjon. Andre histologiske funn som histologisk type, infiltrasjonsdybde (Clark), mitosetall, karinnvekst, lymfocyttinvasjon, mikrosatellitter og render bør også reporteres.
• Kartlegging av somatisk mutasjon for BRAF (ved metastaserende melanom) og NRAS, KIT (ved slimhinnemelanom) er viktig for kategorisering og videre behandling.