Vedlegg 2. Retningslinjer for lymfomdiagnostikk

Introduksjon

Lymfomdiagnostikk ble mer objektiv og samtidig mer komplisert etter at WHO i 2001 publiserte en ny klassifikasjon med retningslinjer for diagnostikk, basert på en foregående europeisk-amerikansk konsensus, Revised European and American Lymphoma (R.E.A.L.) klassifikasjonen. Dette arbeidet ble videreført i den 4. WHO-utgaven i 2008 og  i en ytterligere revisjon i 2017. Hovedpunktene i den siste revisjonen ble publisert i 2016  ien artikkel i tidsskriftet Blood (S. H. Swerdlow et al., 2016)..

Diagnostikken foregår integrert og tar i bruk histologi/cytologi, immunfenotyping, genetikk og kliniske data. Det er en klar tendens i de seneste revideringer at det legges enda mer vekt på molekylærgenetiske funn og integrering av de ovenfor nevnte 4 hovedkriterier. Integreringen kommer trolig til å få enda større betydning i fremtiden, også i lys av at kjente prognostiske parametre i økende grad influerer på behandlingsopplegget.

Ved diagnostikk av lymfom, spesielt ved første gangs diagnose, bør det tilstrebes å klassifisere lymfomet i henhold til den nyeste WHO-klassifikasjonen (S.H. Swerdlow et al., 2017). Muligheten og kompetansen til å kunne bruke og tolke molekylær diagnostikk og utvidete immunhistokjemiske paneler er særlig viktig. Det er nødvendig med integrering av resultater av spesialanalyser sammen med konvensjonell histopatologi, for å kunne gi en samlet tolkning og vurdering. Hematopatologisk virksomhet bør legge til rette for integrering ved utstrakt samarbeid mellom patologer, onko­loger, hematologer, immunologer og genetikere, ikke minst ved å integrere deres laboratorie-informasjonssystemer (LIS). Målet er å kunne stille en endelig diagnose etter de entiteter WHO-klassifikasjonen definerer og så langt det er mulig unngå ufullstendige og upresise diagnoser (som for eksempel ’småcellet lymfom’, ’storcellet B-cellelymfom’ osv.) Patologen bør kunne integrere alle utførte analyser til en fullstendig diagnose i henhold til WHO-kriteriene, slik at man ikke overlater dette ansvaret til kliniker. Ikke minst tillater tilrettelagt integrering hensiktsmessig bruk av ressurser; utfra morfologisk undersøkelse kan riktig panel for immunfenotyping bestemmes, og utfra disse resultatene kan målrettete genetiske analyser rekvireres.

Med de teknologiske krav som stilles til hematopatologisk diagnostikk, vil dette vanligvis inne­bære at endelig diagnose stilles på Regions-/Universitets-sykehus nivå. Generelt anbefales at diagnosene kvalitetssikres av patolog med kompetanse i hematopatologi på tilsvarende nivå.

For pasienter som inkluderes i ’Pakkeforløp for lymfomer’ (Pakkeforløp for lymfomer, 2016), gjelder følgende retninglinjer (sitat):

«For pasienter i Pakkeforløp for lymfomer, må biopsien gå direkte til regional spesial­avdeling for lymfompatologi, som også har mulighet for molekylære undersøkelser. Det må sendes ferskt materiale. Er pasienten inkludert i pakkeforløp skal biopsier merkes CITO. Det er svar på biopsi som avgjør om diagnosen er korrekt og om pasienten har lymfom. Derfor er det helt essensielt at denne vurderingen foretas av patologer med spesiell kompetanse på lymfomdiagnostikk».

Dette heftet omtaler på en kortfattet måte retningslinjer for hematopatologisk diagnostikk i Norge. Følgende emner blir omtalt:

1. Standard behandling inkludert forsendelse, av vev, benmargsbiopsier, benmargsaspirat og blodprøver
2. Standard immunhistokjemiske paneler for lymfomdiagnostikk
3. Molekylærpatologiske analyser for lymfomdiagnostikk
4. Standard besvarelse for lymfomdiagnostikk
5. Koder for lymfoid neoplasi etter norsk SNOMED revisjon 2015

Klaus Beiske, Radiumhospitalet, Oslo Universitetssykehus
Lars Helgeland, Haukeland Universitetssykehus
Håkon Hov, St Olavs Hospital
Lars Uhlin-Hansen, Universitetssykehus Nord-Norge

Faggruppen for hematopatologi i Den norske patologforening, juni 2017.

Signe Spetalen, Ida M. Ikonomou, Irene Langmyhr og Andrej Valkov takkes for verdifulle kommentarer.

1. Standard behandling av vev, benmargsbiopsier, benmargsaspirat og blodprøver

Eksisjonsbiopsi versus nålebiopsi

Vurdering av vevsarkitekturen er et viktig element i lymfomdiagnostikk, noe som optimalt vurderes i en eksisjonsbiopsi. Dette bør derfor tilstrebes ved primærdiagnostikk av lymfom, og bruk av nålebiopsier bør unngås mest mulig. Det kan utelukkende godtas når det klinisk er kontraindisert med eksisjon. Det bør her også påpekes at det ofte ikke kan avgis en endelig lymfomdiagnose på benmargsbiopsi.

Fiksering, nedfrysing, og cellesuspensjoner

Vevet bør forbehandles på følgende måte (og i denne rekkefølgen), der 1 og 2 er minimumstandard for forsvarlig hematopatologisk diagnostikk:

1. God morfologi er noe av det viktigste for diagnostikken. En del av vevet bør derfor fikseres så raskt som mulig. Til vanlig bruker man 4 % bufret formaldehyd, men andre fikseringsvesker basert på Zink (f.eks. Bpluss) kan gi bedre morfologi. Enda viktigere er det å ha tynne snitt (<4µm) for å oppnå best mulig morfologi. Videre kan det være nyttig med imprint-preparater, som tillater bedre vurdering av cytomorfologien av de neoplastiske cellene og gir raskere resultater av FISH undersøkelser enn parafinsnitt. Et typisk eksempel er Burkitt lymfom.
2. En del av vevet bør når det er mulig, fryses med tanke på videre molekylære tester. De fleste aktuelle genetiske tester utføres i dag på fiksert materiale. Dette er imidlertid ikke alltid optimalt grunnet degradering av DNA. Nye teknikker bl.a. dypsekvensering krever optimal DNA-kvalitet.
3. Hvis biopsien er stor nok, er det tilrådelig å ta en del av prøven til flowcytometrisk undersøkelse. Prøven legges fortrinnsvis i celledyrkingsmedium, alternativt fysiologisk saltvann, i påvente av at cellesuspensjon lages. Flowcytometrisk analyse er særlig av interesse for påvisning av abnorme immunfenotyper eller immunoglobulin lett kjede restriksjon (B-celle lymfomer der differensialdiagnose er lymfoid hyperplasi). Multiparameter flowcytometri kan påvise ulike markører samtidig, også på små subpopulasjoner, noe som ikke er mulig med immunhistokjemi, der vurdering av dobbel ekspresjon eller tap av markører kan bli vanskelig, særlig når de neoplastiske celler ligger oppblandet med reaktive celler. Flowcytometri kan også i mange tilfelle gi et raskt foreløpig svar på om det foreligger lymfom og eventuelt type lymfom.
4. Hvis biopsien videre tillater det, kan materiale sendes til cytogenetisk undersøkelse. PCR-analyse eller in situ hybridisering kan ikke erstatte en konvensjonell cytogenetisk undersøkelse fordi sistnevnte er en analyse av hele genomet og ikke bare av ett gen eller én translokasjon. Informasjonen man får gjennom cytogenetikken er i noen tilfeller uunnværlig fordi den kan være den eneste teknikk som beviser at det foreligger en klonal prosess.
5. Forsendelse av prøver

a) Lymfoid vev

Generelt bør biopsi for lymfomdiagnostikk tas tidlig på dagen og helst ikke på fredager på grunn av håndtering av ferskt materiale som beskrevet ovenfor.

Sendes fortrinnsvis ufiksert på en slik måte at det ankommer laboratoriet i løpet av dagen. Åpningstider for laboratoriet bør verifiseres på forhånd. Ufiksert vev skal sendes nedkjølt. Rutiner vedrørende forsendelse, transportmedium, transportbeholder m.v. bør avtales med laboratoriet som skal motta prøven. Dersom det er usikkerheter vedrørende forsendelse, bør rekvirent kontakte laboratoriet når det er aktuelt. Vevsbiten må ikke bli liggende uten væske, da vil den fort tørke ut og tape kvalitet både i forhold til morfologi og tilleggsanalyser.

Alt biopsimaterialet skal følges av utfylt remisse med relevante opplysninger inklusive rekvirent, dato og klokkeslett for biopsitakning.

Dersom biopsimaterialet ikke vil rekke frem innen 24 timer etter biopsitakningen, bør man fiksere minst en halvdel av materialet i formalin, mens den annen del sendes ufiksert og nedkjølt som beskrevet ovenfor. Ved tvil om det er nok vev til å ta av en bit ferskt vev eller om dette vil komme frem til laboratoriet i tide, legges alt vevsmatariale direkte i formalin.

b) Benmarg

Benmargsbiopsier fikseres vanligvis i formalin, eller (alternativt) i en Sink-holdig fikserings­væske, som gir enda bedre morfologi og likevel tillater immunhistokjemisk undersøkelse.

Det er ønskelig at benmargsbiopsi suppleres med utstryk/rullepreparat.

Biopsien bør minimum fikseres i 5 timer og kan ligge i fikseringsvæsken i flere døgn for senere analyse (i tilfelle forsendelse eller lang helg).

Benmargsaspirat og blod sendes ferskt med hensyn på flowcytometrisk undersøkelse og eventuelt molekylærgenetisk og cytogenetisk undersøkelse.

Alt biopsimaterialet skal følges av utfylt remisse med relevante opplysninger inklusive dato og klokkeslett for biopsitakning.

2. Standard immunhistokjemiske paneler for førstegangsdiagnoser

Panelene anbefales brukt systematisk for å unngå feil og for å kunne gi mest mulig fullstendig immunfenotype. Det er like viktig med rapportering av markører som er positive som med oppsummering av markører som er negative. Panelene dekker ikke alle mulige hematopatologiske neoplasier, men dekker de mest hyppige. For mer sjeldne neoplasier bør et utvidet panel av markører brukes etter anbefalinger i WHO-klassifikasjonen. Hvis flowcytometrisk undersøkelse er gjennomført kan panelet begrenses til de markørene som ikke er kommet med (f.eks. Ki67). Panelet bestemmes etter morfologisk vurdering av preparatet, og til en viss grad etter de kliniske opplysninger som foreligger.

Småcellet B-celle lymfom
CD20, CD79a, PAX5, CD138, CD10, BCL2, BCL6, CD3, CD5, CD21, CD23, cyclinD1, SOX-11, IgK, IgL, Ki67

Storcellet B-celle lymfom / Burkitt lymfom
CD20, CD79a, PAX5, MUM1, BCL2, BCL6, CD3, CD5, CD10, CD21, CD23, CD30, EBV (ISH), Ki67, c-Myc

Plasmacelle neoplasi
CD20, CD3, (CD79a, PAX5), CD138, IgK, IgL, IgM, IgG, IgA, cyclinD1, CD56

T-/NK-celle neoplasi
CD3, CD20, CD21, CD2, CD5, CD7, CD4, CD8, TIA1, granzymeB, CD56, CD57, EBV (ISH), CD30, ALK

Hodgkin lymfom
CD30, CD15, CD20, PAX5, CD3, EBV(ISH).

I tillegg ved mistanke om nodulær lymfocyttrik type: CD45, CD79a, BOB1, OCT2, CD57, CD21, MUM1

FL: follikulært lymfom; MCL: mantelcellelymfom; MZL: marginalsonelymfom; KLL: småcellet lymfocytært lymfom/kronisk lymfatisk leukemi; LPL: lymfoplasmacyttisk lymfom; HCL: hårcelleleukemi; TCL: T-celle lymfom; o(o): overflate (sterk); c(c): cytoplasmatisk (sterk); (): reaktivitet i kjente varianter; *bør immunfenotypes ytterligere; ++: høy ekspresjon i alle celler; +: normal ekspresjon i alle celler: +/–: ekspresjon i >50 % av cellene; –/+: ekspresjon i <50 % av cellene.

DLBCL: diffust storcellet B-celle lymfom; PMBL: primært mediastinalt storcellet B-celle lymfom; EDLBCL: ulike EBV+ DLBCL varianter (posttransplant, alders-relatert, betennelse-relatert, lymfomatoid granulomatose, se WHO klassifikasjon); BL: Burkitt lymfom; PDHL: såkalt primært ‘double hit’ lymfom (C-MYC og BCL2 translokasjon); PBL: plasmablastisk lymfom; PEL: primært effusjonslymfom; TCL: T-celle lymfom; ALCL: anaplastisk storcellet lymfom; (): reaktivitet i kjente varianter; * bør immunfenotypes ytterligere etter første screening

DLBCL, UNS bør inndeles videre i lymfomer med kimsentercelle immunfenotype (GCB) etter følgende Hans’ algoritme (definisjon for + er når >30 % av lymfomcellene uttrykker markøren):

En undergruppe av storcellete B-lymfomer er spesielt aggressive og kan være aktuell for annen behandling enn standardbehandlingen for DLBCL. Denne gruppen har ofte trekk av Burkitt lymfom og/eller aberrasjoner i genene som koder for c-myc og bcl-2 og/eller bcl-6. Storcellete B-cellelymfomer skal derfor karakteriseres mtp. aberrasjoner i genet som koder for c-Myc. Den beste analysemetoden er interfase-FISH. Pga. at metoden er arbeidskrevende, er det foreløpig ikke påkrevd at FISH utføres på alle storcellete lymfomer da prevalens av MYC-aberrasjon er lav, men alle skal vurderes mtp FISH. WHO-klassifikasjonen har foreløpig ikke kommet med noen klar anbefaling om hvilke av disse lymfomene som skal gå til FISH. Vi i lymfomgruppen har på bakgrunn av publiserte data og egne erfaringer anbefalt screening av disse lymfomene med immunhistokjemisk undersøkelse for c-Myc. Ved positivitet på over 40–50 % av tumor bør FISH utføres. Ved positiv FISH må man samtidig undersøke om det foreligger BCL2- og/eller BCL6-aberrasjon vha FISH. Storcellete lymfomer med MYC-aberrasjon og/eller samtidig BCL2- og/eller BCL6-aberrasjon klassifiseres i egen gruppe (‘høygradig B-cellelymfom’). Diagnostikk av diffust storcellet B-cellelymfom hvor det ikke er tatt stilling til om det kan foreligge MYC-aberrasjon vil ikke være tilstrekkelig diagnostikk. NB: Det understrekes at utvelgelse av hvilke prøver som skal gå til FISH er patologens ansvar. Imidlertid bør dette utføres i nært samarbeid med onkolog både for å unngå underdiagnostisering (tilfeller der immun c-Myc er under 50 % og påvisning av MYC-aberrasjon vil være klinisk veldig viktig, f.eks. hos unge pasienter) og unngå ressurskrevende diagnostikk der ha liten eller ingen klinisk nytte (hos eldre pasienter eller pasienter med uttalt komorbiditet).

PC: plasmacytom/multippelt myelom; MGUS: monoklonal gammopati av ubestemt betydning;

o: overflate; c(c): cytoplasmatisk (sterk); (): reaktivitet i kjente varianter

LPL er strengt tatt ikke en plasmacelleneoplasi men forvirring kan oppstå med hensyn på differensialdiagnose med den cyclin D1+ varianten av plasmacelleneoplasi, som likeledes består av små lymfoplasmacytoide plasmaceller.

PTCL, UNS: perifer T-celle lymfom, UNS; AILT: angioimmunoblastisk TCL;

EATCL: enteropati-assosiert TCL; HSTCL: hepatosplenisk TCL; ALCL, ALK+: anaplastisk storcellet lymfom, ALK+; ALCL, ALK-: anaplastisk storcellet lymfom, ALK-; MF: mycosis fungoides; SS: Sézary syndrom; TPLL: T-celle prolymfocytisk leukemi; TLGL: T-celle stor granulær lymfocytisk leukemi; ANKCL:: agressiv NK-celle lymfom; ATCLL: adult T-celle leukemi/lymfom; ENK/TCL: ekstranodal NK/T-celle lymfom; SPTCL: subkutan pannukulitt-lignende TCL;PCGDTCL: primært kutant gamma-delta TCL; C: cytoplasmatisk; () reaktivitet i bestemte lymfomsubtyper;

* Vær oppmerksom på at markøren er positiv i en rekke B-celle lymfomer.

KHL: klassisk Hodgkin lymfom; ALCL: anaplastisk storcellet lymfom;

* Bør immunfenotypes ytterligere etter første screening

3. Standard molekylærpatologiske undersøkelser

1. PCR analyser

B-celle neoplasi
Immunglobulin genrearrangering anbefales brukt som panel i de tilfellene hvor det er usikkert om det foreligger B-celle neoplasi eller reaktiv B-celle hyperplasi (f.eks. små endoskopiske biopsier, minimal infiltrasjon av marginalsonelymfom i lymfeknutebiopsi osv). Det anbefales sterkt at BIOMED-2 protokoller brukes. Ekstern kvalitetssikring anbefales både når det gjelder teknikk og tolkning.

Ved differensialdiagnostikk av lymfoplasmacyttisk lymfom versus andre småcellede B‑cellelymfomer, anbefales analyse av MYD88 mutasjon.

Ved usikkerhet ved diagnose hårcelleleukemi anbefales analyse av BRAF mutasjon.

T-celle neoplasi 
T-cellereseptor genrearrangering anbefales brukt i alle tilfeller av T-celle lymfomer, med BIOMED-2 protokoller. Disse lymfomene er relativt sjeldne og testen øker sikkerhetsgraden av denne alvorlige diagnosen betraktelig.

2. FISH

Interfase FISH på vevsmateriale bør utføres der morfologi og immunfenotype gir mistanke om Burkitt lymfom. Det bør da analyseres med hensyn på MYC-translokasjon med break apart probe. Ved storcellete lymfomer skal det vurderes å utføre FISH mtp. MYC-translokasjon og eventuelt supplere med analyse av BCL2- og BCL6-translokasjoner for deteksjon av ’dobbel-hit’ eller ’trippel-hit’ lymfom, se over under storcellede B-cellelymfomer. FISH analyse av CCND1 translokasjoner er aktuell ved Cyclin D1-negativt mantelcellelymfom. Et hematopatologisk laboratorium bør også kunne utføre FISH for rearrangeringer av IRF4/DUSP22 genet, som forekommer ved en undergruppe av storcellete B-cellelymfomer hos yngre individer og har en noe bedre respons på behandling enn andre storcellete lymfomer, og hos en undergruppe ALK-negative anaplastiske storcellete lymfomer med bedre prognose.

Ved B-lymfoblastiske lymfomer/leukemier bør det legges til rette for genetisk testing, både molekylærgenetisk analyse, FISH og klassisk cytogenetikk.

Klassisk cytogenetikk utføres vanligvis ikke i patologilaboratorier. Dersom cytogenetiske undersøkelser er aktuelt må laboratorium som utfører slike analyser kontaktes.

4. Standard besvarelse for hematopatologi

Makroskopi 

1. Det bør beskrives alt som er mottatt og hvordan glass er merket.
2. Deretter beskrives systematisk mål på vevsbiopsiene og hvordan vevet er viderebehandlet: type fiksering inkludert hvor mange og nummerering av briketter, nedfrysing, og om eventuelt deler av vevet er sendt videre til cytogenetikk, molekylær analyse, flowcytometrisk analyse eller om det finnes restvev etter behandlingen

Mikroskopi

1. Lymfoid vev

Følgende standard elementer (fet skrift) anbefales:

Vevstype

Biopsikvalitet: (tilfredsstillende, uegnet for diagnostikk, suboptimal for diagnostikk)

FOR IKKE-NEOPLASTISKE SYKDOMMER: beskriv først arkitektur (kapsel, sinuser, B-celle området, T-celle området, pulpa), deretter celletyper og deretter resultater fra immunfenotyping, immungenotyping eller FISH.

FOR NEOPLASTISKE SYKDOMMER:

• Type neoplasi etter WHO klassifikasjon: (for eksempel follikulært lymfom grad 1–2, diffust storcellet B celle lymfom, osv.)
• Arkitektur: (diffust,nodulært, ekstranodulært, perivaskulært, osv.)
• Celletype: (beskrivelse av cellenes morfologi)
• Immunfenotype: (oppsummering av immunfenotype også hvis resultatet er negativt. For eksempel: CD45+, CD20+, CD3-, osv.). Her kan det også henvises til resultater fra eksterne undersøkelser, f.eks. flowcytometrisk undersøkelse.

• immungenotype: (resultat fra immunglobulin- og T-celle reseptor genrearrangering)
• interfase genetikk: (resultat fra kromosomanalyse ved FISH)

2. Benmargsbiopsier

Følgende standard elementer (fet skrift) anbefales:

Vevstype:

Biopsikvalitet: (tilfredsstillende, uegnet for diagnostikk, suboptimal for diagnostikk)

Hematopoiese:

Cellularitet: (beskriv celletetthet i % av det samlede intertrabekulære rom)

Erytropoiese: (beskriv egenskaper: relativ andel, vekstmønster og morfologi)

Myelopoiese: (beskriv egenskaper: relativ andel, vekstmønster og morfologi)

Trombopoiese: (beskriv egenskaper: relativ andel, vekstmønster og morfologi)

Lymfoide celler: (gjelder ikke-lymfoid neoplasi, i tilfelle lymfoid neoplasi droppes denne beskrivelsen. Beskriv egenskaper: relativ andel, vekstmønster og morfologi)

Ikke-hematopoietisk celleinfiltrasjon: (beskriv. For eksempel: granulomatøs betennelse osv.)

Fibrose: (graderes etter WHO klassifikasjon ved Gomorifarging: grad 0/1/2/3. Dette gjøres spesielt ved alle primære benmargssykdommer)

Benvevet: (beskriv egenskaper: arkitektur og morfologi)

Resultat fra immunhistokjemisk undersøkelse (hvis aktuelt): prosent andel av CD34+ celler bør nevnes i tilfelle dysplasi.

Tumorinfiltrasjon: (droppes hvis ikke aktuelt. Det kan være aktuelt selv om det ikke finnes tumor, med beskrivelsen ’ikke påvist’ i tilfelle spesifikt klinisk spørsmål om tumorinfiltrasjon)

• type tumor: (karsinom, lymfom, osv.)
• infiltrasjonsandel: (% av det samlede intertrabekulære rom)
• infiltrasjonsmønster: (fokalt, diffust interstitielt, diffust massivt, nodulært, peritrabekulært, intertrabekulært, intrasinusoidalt)
• celletype: (beskrivelse av cellenes morfologi)
• immunfenotype: (oppsummering av immunfenotype. For eksempel: cytokeratin +, PSA+, CEA+ osv.)

Diagnose

Følgende rekkefølge anbefales:

1. biopsiens vevsart, type og topografi (f.eks. benmargsbiopsi fra venstre crista, lymfeknutebiopsi fra venstre aksille, nålebiopsi fra lymfeknute i abdomen)
2. diagnose etter WHO-klassifikasjon (her bruker man felles oversettelse av WHO-klassifikasjon, se vedlegg)

Vurdering

Diskusjon om diagnosen bør beskrives i separate felt, hvis nødvendig. Det er alltid viktig å ta opp eventuelle spørsmål som kliniker har stilt, skriftlig eller muntlig. For eksempel: ’det foreligger ingen holdepunkter for histologisk transformasjon’ ’Selv om pasienten har generell glandelsvulst, har vi ingen holdepunkt for neoplasi i foreliggende lymfeknutebiopsi’. Det er også særlig viktig å ta opp tilleggsundersøkelser som må til for å kunne stille diagnose etter WHO kriteriene.

Koding

Liste med morfologi-koder er vedlagt. Listen er basert på internasjonalt godkjente koder og anbefales brukt i Norge.